Preanalytische voorschriften voor stollingsbepalingen

Uit Stolling en Antistolling
Ga naar: navigatie, zoeken

Pre-Analytische Voorschrifte NVVC


Inleiding

De activiteit van de bloedstollingsfactoren in vitro kan worden beïnvloed door de omstandigheden waaronder het bloed en plasma zijn verkregen en bewaard. Hierbij spelen vele factoren een rol, zoals de oppervlakken waarmee het bloed c.q. plasma in aanraking komt, de pH, de temperatuur en de aanwezigheid van bloedplaatjes. Ook speelt de tijdsduur tussen venapunctie en stollingsbepaling een belangrijke rol. De optimale preanalytische omstandigheden zijn niet voor alle bepalingen identiek. Sommige bepalingen (bijvoorbeeld de aPTT bij heparine-monitoring) zijn gevoeliger voor preanalytische variaties dan andere (bijvoorbeeld de PT/PT-INR). Er bestaat in de literatuur geen volledige overeenstemming over de optimale omstandigheden. In het huidige voorschrift is een keuze gemaakt uit de bestaande literatuur.

Venapunctie

  • Veneus bloed wordt standaard verkregen door middel van een vacuüm systeem.
  • Desinfectie van de huid voor venapunctie is bij patiënten zonder verminderde weerstand tegen infectie niet nodig (Werkgroep Infectiepreventie, richtlijn Algemene Huiddesinfectie 2003).
  • Alle containers moeten zijn vervaardigd van niet-reactieve materialen, zoals polypropyleen of gesiliconeerd glas
  • 19-21 gauge naalden zijn optimaal. Zowel te kleine als te grote naaldopeningen kunnen hemolyse induceren.
  • Het bloed moet vlot stromen en moet onmiddellijk goed worden gemengd met anticoagulans d.m.v. voorzichtig kantelen van het buisje (minimaal 3-6 volledige kantelingen in de lengterichting).
  • Gebruik van een stuwband mag niet langer dan 1 minuut plaatsvinden. De druk moet ongeveer 10 mm Hg (1,33 kPa) onder de diastolische bloeddruk zijn. Zodra het bloed stroomt, moet de stuwband worden losgelaten.
  • Indien de PT/PT-INR of aPTT moet worden uitgevoerd, is de eerste buis bloed adequaat. Eerder werd voor de bepaling van stollingsfactoren gesteld dat de eerste buis moest worden weggegooid en de tweede buis moest worden gebruikt. De onderbouwing hiervoor is op zijn best indirect en inmiddels kan gesteld worden dat deze praktijk bij gebruik van een standaard vacuüm systeem niet meer vereist is. Zij kan nog worden overwogen bij een moeizame venapunctie maar in de meeste gevallen zal dan een tweede venapunctie in de andere arm nodig zijn.
  • Het wordt afgeraden om bloedmonsters via katheters af te nemen. Als dit niet kan worden vermeden moeten heparine contaminatie en monsterverdunning worden voorkomen door de lijn te spoelen met 5 ml NaCl 0.9% en de eerste 5 ml bloed of 6 maal het dode volume van het systeem weg te gooien.
  • De aanbevolen volgorde van afname is:
  1. bloedkweek
  2. citraatbuis
  3. serumbuis met of zonder stollingsactivator of gel
  4. heparinebuis met of zonder gel
  5. EDTA buis
  6. buis met glycolyseremmer
  • Het is ook mogelijk bloed af te nemen met behulp van een vleugelnaald. Bij gebruik van een spuit met bloed moet deze onmiddellijk (binnen 1 minuut) in een citraatbuis worden geleegd door de tuit tegen de wand van het buisje te houden, zodat het bloed langs de wand naar beneden stroomt en er geen schuimvorming of overmatigeturbulentie optreedt.
  • Buizen met bloed dienen goed afgesloten te worden bewaard.
  • Een aantal bepalingen, bijvoorbeeld van factor VIII en diverse fibrinolyse parameters, kan worden beïnvloed door stressfactoren. * De patiënten hoeven niet nuchter te zijn.
  • Vetrijke maaltijden kunnen optische meetmethoden verstoren.
  • Na afname dient het volume van het bloedmonster te worden gecontroleerd. Onder- of overvulling is een preanalytische fout, die consequenties voor de uitslag kan hebben.

Afname- en opslagbuizen

  • Kunststof buizen zijn geschikt indien deze geen contactactivatie veroorzaken.
  • Ook gesiliconeerde glazen buizen kunnen worden gebruikt.
  • Vacuümbuizen van zowel kunststof (bijvoorbeeld polypropyleen) als gesiliconeerd glas zijn in de handel verkrijgbaar. De samenstelling van het buismateriaal en het fabricageproces van de buizen kunnen van invloed zijn op de uiteindelijke testresultaten. Zo bleken de resultaten van PT en PT-INR uit bloed afgenomen in een glazen buis hoger of lager te zijn dan uit bloed afgenomen in een kunststof buis.
  • Bij een overstap van glas naar kunststof maar ook bij een verandering van buizen fabrikant is daarom een validatie op basis van een parallel onderzoek, gebruik makend van monsters in de normale range en daarbuiten, noodzakelijk.

Anticoagulans

  • Het bij stollingsonderzoek gebruikte anticoagulans is trinatriumcitraat (0,105 tot 0,109 mol/l). Sommige laboratoria gebruiken nog een hogere citraat concentratie (3,8% trinatriumcitraat 2 H2O; dit is 0,129 mol/l). Deze laboratoria wordt dringend aangeraden de door de SSC (ISTH) aanbevolen concentratie (0,109 mol/l) te gaan gebruiken voor de bepaling van de PT/PT-INR. Vanwege de verwaarloosbare verschillen zijn citraat concentraties van 0,105 en 0,106 mol/l ook acceptabel
  • Vanuit een praktisch oogpunt is het gewenst de voor de PT/PT-INR aanbevolen citraat concentratie ook voor de andere stollingsbepalingen te gebruiken.
  • Eén volumedeel anticoagulans wordt gemengd met negen volumedelen bloed.
  • Vanuit wetenschappelijk oogpunt zou deze verhouding anders gekozen moeten worden, indien de hematocriet van het bloed lager dan 0,20 of hoger dan 0,55 is. De invloed van de anticoagulans:bloed verhouding op de PT/PT-INR en aPTT is verwaarloosbaar mits deze tussen 1 + 8 en 1 + 12 ligt
  • Een mengsel van citroenzuur en natriumcitraat (pH 5-6) kan ook worden gebruikt mits de totale citraat + citroenzuur concentratie 0,105 - 0,109 mol/l is.
  • Indien de tijd tussen venapunctie en meting langer dan 2 uur is wordt een speciale anticoagulans oplossing (CTAD mengsel: 0,109 mol/l citroenzuur, 0,015 mol/l theophylline, 0,0037 mol/l adenosine en 0,198 mmol/l dipyridamol, pH met NaOH op 5,0 gesteld) aanbevolen voor het bewaken van heparine therapie. CTAD remt het vrijkomen van plaatjesfactor 4 dat heparine inactiveert.


Transport naar het laboratorium

Tijdens het transport van bloedmonsters naar het laboratorium dienen de daarvoor gebruikte buizen in verticale positie te worden vervoerd.


Centrifugeren van het bloed

  • Om plasma te verkrijgen dienen de buizen afgesloten te worden gecentrifugeerd bij een snelheid en gedurende een tijd die benodigd zijn om consistent bloedplaatjesarm plasma te produceren (< 10 x 109/l trombocyten). De centrifugatie snelheid en tijd

moeten door het laboratorium zelf worden getest en gevalideerd maar veel gebruikte condities zijn 1.500 x g gedurende minstens 15 minuten.

  • Centrifugeren met een hogere snelheid en gedurende een kortere tijd (bijvoorbeeld in microcentrifuges) kan, opnieuw na validatie, eventueel voor citomonsters worden toegepast.
  • Voor de PT/PT-INR en aPTT in vers plasma kan korter worden gecentrifugeerd (5 of 10 minuten). Deze bepalingen zijn ongevoelig voor trombocyten aantallen tot minstens 200 x 109/l.
  • Moderne centrifuges zijn met een thermostaat uitgerust. De aanbevolen temperatuur voor het centrifugeren van bloed voor stollingsbepalingen is “kamertemperatuur”. Van centrifugeren bij lagere temperaturen (4 oC, 12 oC) is inmiddels beschreven dat er geen significant effect op de aPTT, PT, Fbg en Ddimeren resultaten is gevonden. Het risico op koude activatie van bijvoorbeeld factor VII overwegend lijkt een temperatuurgebied tussen koelkast- en kamertemperatuur (13 – 21 oC) daarom acceptabel.
  • Na centrifugeren wordt het plasma voorzichtig afgepipetteerd met een plastic pipet.
  • Bloedplaatjes en/of bloedcellen kunnen de gevoeligheid van de bepaling van Lupus Anticoagulans beperken, in het bijzonder na invriezen van plasmamonsters. Voor de bepaling van Lupus Anticoagulans geldt daarom de eis dat het plasma “bloedplaatjesvrij” moet zijn. Dit plasma kan voorafgaand aan het invriezen op verschillende manieren worden bereid:
    • door het afgepipetteerde plaatjesarme plasma nogmaals op dezelfde wijze te centrifugeren en over te brengen in een schone buis. NB: het plasma moet voorzichtig worden afgepipetteerd zonder het gesedimenteerde materiaal te beroeren.
    • door het afgepipetteerde plasma 5 minuten bij 10.000 x g te centrifugeren in een microcentrifuge en over te brengen in een schone buis. NB: het plasma moet voorzichtig worden afgepipetteerd zonder het gesedimenteerde materiaal te beroeren
    • door het afgepipetteerde plasma langzaam te filtreren door een 0,2 Om celluloseacetaat filter. Deze methode is niet voor alle stollingstesten geschikt (selectieve verwijdering van factor V, VIII, IX, XII en von Willebrand factor) en wordt daarom ontraden.


Hemolytische monsters

  • Na centrifugering van het bloed dient het verkregen plasma te worden geobserveerd om mogelijke hemolyse te detecteren.
  • Hemolyse kan plaatsvinden in vivo (intravasculaire hemolyse) of in vitro gedurende of na het vullen van de bloedafnamebuis. Bij rode cel lysis komen behalve hemoglobine (Hb) ook andere intracellulaire en membraancomponenten vrij in het plasma.
  • In sommige stollingsanalyzers met foto-optische eindpuntsdetectie kunnen problemen ontstaan met monsters die vrij Hb of andere stoffen bevatten die lichttransmissie kunnen storen.
  • Ieder laboratorium dient zelf na te gaan of dit van toepassing is op het eigen instrument.
  • De door hemolyse vrijgekomen intracellulaire en membraancomponenten kunnen stollingsfactoractivatie veroorzaken. Er is een tendens naar verkorte PT en APTT in gehemolyseerde monsters van patiënten. Het resultaat van routine stollingsbepalingen (PT, APTT, fibrinogeen) wordt minder betrouwbaar bij in vitro hemolyse met een vrij Hb concentratie > 0.1 mMol/l.
  • Indien er sprake is van intravasculaire hemolyse waarbij de mogelijke stollingsactivatie past bij de toestand van de patiënt, kan het monster in behandeling worden genomen.
  • Indien er sprake is van in vitro hemolyse met een vrij Hb concentratie > 0.1 mMol/l, dient het monster niet in behandeling te worden genomen.

Bewaren van bloed en plasma

  • Gecentrifugeerde monsters voor de PT/PT-INR en van niet-gehepariniseerde patiënten voor de aPTT kunnen met het plasma op de cellen in een niet-geopende buis worden bewaard.
  • Niet-gecentrifugeerde en gecentrifugeerde bloedmonsters voor de PT/PT-INR bepaling moeten, in een niet-geopende buis, bij 18 – 24 ° C worden bewaard. De bepaling moet binnen 24 uur worden uitgevoerd.
  • Bewaren bij 2 – 4° C kan koude activatie van factor VII geven, waardoor de resultaten van de PT kunnen veranderen.
  • Sommige PT reagens – apparaat combinaties zijn gevoeliger dan andere en geven na 24 uur of zelfs binnen 6 - 24 uur bewaren van nietgecentrifugeerd bloed een grote verandering te zien, zowel bij kamertemperatuur als bij 4-6º C; laboratoria wordt daarom aangeraden dit voor de eigen reagens – apparaat combinatie te controleren.
  • Bloedmonsters voor de PT/PT-INR mogen niet langer dan 6 uur bij 37º C worden bewaard, wat van belang is voor het transport per auto op warme dagen.
  • Bloedmonsters voor controle van ongefractioneerde heparine of laagmoleculair heparine dienen binnen 1 uur na de venapunctie te worden gecentrifugeerd en na centrifugeren en afpipetteren moet het plasma binnen 4 uur na venapunctie worden geanalyseerd.
  • Tijdens voornoemde periode van 4 uur kan het plasma zowel bij een temperatuur van 2 – 4° C of van 18 – 24° C worden bewaard.
  • Bloedmonsters voor bepaling van D-dimeer moeten binnen 6 uur worden gecentrifugeerd.
  • Plasma monsters voor bepaling van D-dimeer kunnen tenminste 1 week bij 4º C worden bewaard.
  • Indien het plasma langer moet worden bewaard, tot maximaal twee weken, moet het (plaatjesarm,) ingevroren worden bij een temperatuur van –20°C of lager.
  • Plaatjesarm plasma, bewaard bij -70°C, is tenminste 12 maanden houdbaar (criterium: de uitkomst van individuele stollingstesten wijkt minder dan +/- 10% af van het uitgangsresultaat).
  • Ook bij -70°C loopt de factor VIII:C activiteit echter langzaam terug.
  • Het ingevroren plasma kan in een waterbad bij 37°C worden ontdooid totdat tenminste kamertemperatuur bereikt is. In de praktijk blijkt 5 minuten voldoende te zijn bij een volume van 1 ml plasma. Na mengen dient het monster onmiddellijk voor de bepalingen te worden gebruikt.
Test Volbloed 18-24°C 2-4°C (-20°C/-70°C) Plasma 18-24°C 2-4°C (-20°C*) (-70°C*)
PT/PTINR 24 uur Niet acceptabel Niet acceptabel 24 uur Niet acceptabel 2 wk 12 mnd
aPTT 4 uur 4 uur Niet acceptabel 4 uur 4 uur 2 wk 12 mnd
Fbg, FV en FVIII, AT 4 uur 4 uur Niet acceptabel 4 uur 4 uur 2 wk 12 mnd
LAC 4 uur Niet acceptabel Niet acceptabel 4 uur 4 uur 2 wk NB
D-dim 6 uur Niet acceptabel Niet acceptabel 6 uur 1 week 2 wk 12 mnd